Влияние хлорида кальция на стабильность и антимикробную активность низина

Богатство вкусов и ароматов

Влияние хлорида кальция на стабильность и антимикробную активность низина

Основано на материале статьи: Effect of CaCl₂ on the stability and antimicrobial activity of nisin, IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 2021

#POPOVER1#Низин#/POPOVER# может эффективно подавлять рост грамположительных бактерий (таких как Bacillus subtilis и Clostridium), поэтому он широко используется в пищевой промышленности. Будучи природным антимикробным #POPOVER2#пептидом#/POPOVER#, низин не токсичен для человека и легко гидролизуется #POPOVER3#протеазами#/POPOVER# и #POPOVER4#карбоксипептидазами#/POPOVER#. Низин может предотвратить порчу продуктов питания, не изменяя их сенсорных и вкусовых характеристик. Таким образом, низин имеет широкий спектр применения и развития в пищевой промышленности.

Однако уязвимость к потере антимикробной активности в нейтральной или щелочной среде pH ограничила его применение. Предыдущие исследования показали, что двойная связь ненасыщенной #POPOVER5#аминокислоты#/POPOVER# может связывать #POPOVER6#нуклеофильные вещества#/POPOVER# в нейтральном или щелочном pH, а сила молекулы приводит к #POPOVER7#полимеризации#/POPOVER# низина и, следовательно, ослаблению его антимикробной активности. Множество свидетельств указывает на то, что #POPOVER8#дегидроаланин#/POPOVER# (Dha), который является необычным аминокислотным остатком низина, участвует во всех продуктах #POPOVER9#деградации#/POPOVER# низина. И в частности, модификация Dha в положении 5 (Dha5) приводит к серьезной потере антимикробной активности. Эти предыдущие исследования показали, что целостность ненасыщенных аминокислот является важным фактором химической стабильности низина.

Считалось, что ненасыщенные остатки аминокислот легко подвергаются воздействию термической обработки и высокого pH. Предыдущие исследования показали, что Ca²⁺ может ковалентно связываться с боковыми цепями некоторых аминокислотных остатков, таких как Asp и Glu, и таким образом повышать стабильность и активность белков. Поэтому настоящее исследование будет посвящено изучению влияния хлорида кальция на термическую стабильность и антимикробную активность низина. Для выявления механизма защиты низина с помощью хлорида кальция были проведены #POPOVER10#рентгеновская дифракция (XRD)#/POPOVER#, #POPOVER11#сканирующая электронная микроскопия (SEM)#/POPOVER11#, #POPOVER12#термогравиметрический анализ (TGA)#/POPOVER#, #POPOVER13#инфракрасная спектроскопия с Фурье-трансформацией (FT-IR)#/POPOVER# и #POPOVER14#круговой дихроизм (CD)#/POPOVER#. Результаты данного исследования могут быть использованы для повышения термической стабильности и антимикробной активности низина и расширения его применения при обработке пищевых продуктов.

Определение титра низина

Для определения титра низина использовался модифицированный метод диффузии в агар. 100 мкл раствора низина (раствор низина 2 мг/мл был разбавлен в 300 раз и 600 раз 0,02 моль/л HCl, то есть высоко- и низкодозированный раствор низина) добавляли в лунку твердой чашки Петри, содержащей суспензию индикаторных бактерий, и затем культивировали при 30 °C в течение 24 ч.

Влияние хлорида кальция на антимикробную активность низина

Как видно, титр низина снижался на 0,00%, 5,60% и 8,78%, соответственно, при увеличении pH от 2,0 до 6,0 при 25°C (рис. 1). Между тем, при повышении температуры до 121°C титр низина резко снижался. Потеря антимикробной активности составила 25,19% и 56,17% при pH 4,0 и 6,0, соответственно. Однако при добавлении хлорида кальция потеря антимикробной активности низина явно уменьшилась. Потеря антимикробной активности низина с хлоридом кальция снизилась с 25,19 до 14,16% и с 56,17 до 29,29% при pH 4,0 и 6,0, соответственно, по сравнению с низином без хлорида кальция. При тепловой обработке (121°C) хлорид кальция показал значительный положительный эффект на низин. Потеря антимикробной активности низина с хлоридом кальция снизилась на 11,03% и 26,88%, соответственно.

Антимикробная активность и стабильность низина тесно связаны со структурой и могут изменяться под влиянием pH. Низин более стабилен при более низком pH, чем при более высоком. Результаты нашего исследования показали, что на антимикробную активность низина минимально влияет нагревание при низком pH (2,0). Антимикробная активность низина при тепловой обработке быстро снижалась при повышении pH до 4,0 и выше. Белок обычно протонирован при низком pH, что благоприятно для сохранения первоначальной #POPOVER15#конформации#/POPOVER# белка. Однако с увеличением pH протонирование низина снижалось, происходила полимеризация и потеря антимикробной активности низина.

Антимикробная активность низина явно изменялась при добавлении хлорида кальция (рис. 1). Скорость потери антимикробной активности низина с хлоридом кальция была ниже, чем без хлорида кальция. Защитный эффект хлорида кальция был более заметен при тепловой обработке. Скорость потери антимикробной активности низина с хлоридом кальция была на 11,03% ниже, чем у низина без хлорида кальция при pH 4,0. Защитный эффект хлорида кальция был более выражен при pH 6,0, при этом скорость потери антимикробной активности снизилась на 26,88% по сравнению с низином без хлорида кальция.

Как показано на рис. 2, диаметр зоны #POPOVER16#ингибирования#/POPOVER# низина с хлоридом кальция был явно больше, чем без хлорида кальция при различных pH. Диаметр зоны бактериостатического действия низина с хлоридом кальция не изменялся в зависимости от pH, и его потеря антимикробной активности была меньше, чем у низина без хлорида кальция после тепловой обработки. Эти результаты показали, что хлорид кальция положительно влияет на термическую стабильность и антимикробную активность низина.

Влияние хлорида кальция на морфологию низина

Морфологию микрочастиц наблюдали с помощью СЭМ (рис. 3). Поверхность низина была более шероховатой и неровной. Благодаря присутствию хлорида кальция образовалась плотно сшитая структура низина, а размер был больше, чем без хлорида кальция. Предыдущее исследование показало, что хлорид кальция совместим с белками из-за электростатических взаимодействий между Ca²⁺ и низином, и он может связываться с некоторыми аминокислотными остатками белка для стабилизации конформации белка. Это может эффективно ингибировать гидролиз белка. Таким образом, результаты SEM показали, что хлорид кальция способствует сохранению стабильности низина.

Рисунок 3. Влияние хлорида кальция на морфологию низина. (a): Лиофилизированный низин без хлорида кальция (масштабная линейка = 10 мкм); (b): лиофилизированный низин с хлоридом кальция (масштабная линейка = 10 мкм).

Влияние хлорида кальция на термическую стабильность низина

Термическая стабильность низина с хлор и без него была исследована с помощью ТГА анализа (Таблица 1).

Таблица 1. Температура термического разложения низина с и без хлорида кальция при различных рН

Образец	Т₅^а(⁰С)	Т₅₀^b(⁰С)	Т₉₅^c(⁰С)	Т_p^d(⁰С)
Низин-рН 2.0	136	222	681	162
Низин-рН 4.0	129	218	668	155
Низин-рН 6.0	127	216	645	136
Низин+CaCl₂-рН 4.0	137	220	676	160
Низин+CaCl₂-рН 6.0	140	226	678	178

Примечание:a - температуры потери 5% массы;b - температуры потери 50% массы;c - температуры потери 95% массы;d - температуры пиков основного разложения.
T₅ , T₅₀ и T₉₅, полученные из кривой ТГА, представляют собой температуры 5%, 50% и 95% потери массы при пиролизе, соответственно. Результаты показали, что T₅ и T₉₅ низина снизились с 136°C до 127°C и с 681°C до 645°C, соответственно, при изменении pH от 2,0 до 6,0 (Таблица 2).

Таблица 2. Влияние хлорида кальция на ИК-Фурье пики

Волновое число пика (см^-1)					Характеристика пиков
рН 2.0	рН 4.0	рН 6.0	рН 4.0- CaCl₂	рН 6.0- CaCl₂	Характеристика пиков
3395	3397	3421	3392	3406	О-Н растяжение пик вибрации
2932	2932	2935	2929	2927	С-Н растяжение пик вибрации
1624	1629	1633	1627	1630	СОО- ассиметричное растяжение пик вибрации
1232	1236	1260	1229	1246	О-Н растяжение пик вибрации
1033	1033	1053	1015	1032	С-О-С растяжение пик вибрации

Снижение T₅ и T₉₅ подтвердило отрицательное влияние повышения pH на термическую стабильность низина. Аналогичное наблюдение было отмечено ранее, при pH 2,0 не было потери активности низина после 15 минут при 121°C, но была 40% потеря активности при pH 5,0 и 90% потеря при pH 6,8. Сохранение активности низина после нагревания в течение 15 минут при 121°C сильно зависит от pH.
При добавлении хлорида кальция, T₅ низина составляла 137°C и 140°C при pH 4,0 и 6,0, соответственно, а температуры пиков основного разложения (Tp) низина с хлоридом кальция составляли 160°C и 178°C, соответственно, что было явно выше, чем без хлорида кальция, и так же, как T₅₀ . Между тем, температура T₉₅ низина с хлоридом кальция также была увеличена с 668°C до 676°C при pH 4.0 и с 645°C до 678°C при pH 6.0. Эти результаты позволяют предположить, что добавление хлорида кальция может увеличить температуру термического разложения низина и повысить его термическую стабильность.

Влияние хлорида кальция на ИК-Фурье низина

В таблице 2 показаны изменения ИК-Фурье спектральных пиков низина с хлористым кальцием и без него при различных pH. ИК-Фурье спектр низина показал характерные полосы поглощения при 3395 см⁻¹ (растягивающие колебания O-H), 2932 см⁻¹ (растягивающие колебания C-H), 1624 см⁻¹ (асимметричные растягивающие колебания COO), 1232 см⁻¹ (растягивающие колебания O-H) и 1033 см−1 (растягивающие колебания C-O-C). Было обнаружено, что волновое число C-O-C уменьшилось с 1033 и 1053 см⁻¹до 1015 и 1032 см⁻¹ , а волновое число O-H уменьшилось с 3397 и 3421 см⁻¹ до 3392 и 3406 см⁻¹ соответственно, при pH 4,0 и pH 6,0 при добавлении хлорида кальция, что может быть связано с увеличением водородной связи низина. Низин был помещен в микрочастицы альгината натрия (Alg) и альгинатно-резистентного крахмала (Alg-RS), а добавление резистентного крахмала в альгинатную формулу вызвало снижение волнового числа O-H с 3430 до 3411 см⁻¹. Эти изменения согласуются с увеличением водородной связи частиц. Эти результаты еще больше подтвердили наши первоначальные предположения о том, что добавление хлорида кальция защищает исходную молекулярную структуру и активные группы низина и повышает стабильность его пространственной структуры.

Влияние хлорида кальция на рентгеновскую дифракцию низина

Рентгеновские дифрактограммы хлорида кальция, низина с хлоридом кальция и без него показаны на рис. 4. При 25°C пики кристаллизации хлорида кальция имели значения 2θ=14,82°, 19,28°, 20,68°, 21,18°, 29,52°, 32,02°, 32,16°, 43,02° (рис. 4a). В то же время был обнаружен заметный пик низина при 31,7-31,8° (рис. 4b). Это соответствует характерной дифракционной картине хлорида натрия (NaCl), который является компонентом низина.

Проведенные исследования позволяют предположить, что Ca²⁺ связался с пептидом малой молекулы низина, и это вызвало изменение конформации белка при pH4.0 (рис. 4c). В этот момент, на основании ослабления характерного пика низина на рис. 6b, можно сделать вывод, что низин как маленькая молекула пептида соединился с Ca²⁺ посредством ионных взаимодействий, что способствовало совместимости двух веществ и нарушению полимеризации низина (рис. 4c). При соединении двух веществ характерный пик CaCl₂ в основном отсутствовал, а характерный пик низина в положениях 3, 4 и 5 был шире (рис. 4c), проявлялись аморфные структурные особенности, что было вызвано избыточным количеством низина. Интенсивность кристаллических пиков уменьшалась при увеличении концентрации низина. Частицы демонстрируют #POPOVER17#аморфную структуру#/POPOVER#, когда концентрация низина достигает 5000 МЕ/см². Был сделан вывод, что низин как инородное вещество нарушает формирование полиморфных кристаллов.

При pH 6,0 интенсивность характерного пика низина с хлоридом кальция в том же положении была слабее, чем при pH 4,0. Куртоз в положениях 3, 4 и 5 стал шире, а положения 4 и 5 практически исчезли (рис. 4d). Это позволило предположить, что при увеличении pH связывание Ca2+ и низина становится более тесным за счет ионно-белковых и электростатических взаимодействий.

Как показано на рис. 4e и рис. 4f, видно, что характерные пики и аморфные пики низина с хлоридом кальция существенно не изменились. После термообработки не образовалось новых пиков в слабокислой среде (pH 4,0-6,0). Было показано, что стабильные структуры низина с хлоридом кальция не разрушались при тепловой обработке, что позволило предположить, что хлорид кальция может эффективно защищать стабильную конформацию низина.

Можно сделать следующие выводы:

_{- термическая стабильность и антимикробная активность низина могут быть явно улучшены с помощью хлорида кальция.}

_{- анализ сканирующей электронной микроскопии и рентгеноструктурный показали, что хлорид кальция может улучшить структуру низина при pH 4,0 и 6,0.}

- анализ термогравиметрии показал, что добавление хлорида кальция во время термообработки в слабокислой среде улучшило химико-термическую стабильность низина. Кроме того, результаты ИК-Фурье показали, что добавление хлорида кальция может защитить водородные связи низина и, следовательно, повысить стабильность низина.